no RSAVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA MINERAL NATURAL E DE TAMPAS PLÁSTICAS UTILIZADAS EM UMA INDÚSTRIA DA GRANDE PORTO ALEGRE/RS
RESUMO:
Embora a presença de bactérias seja esperada em águas minerais naturais, contaminações elevadas podem ocorrer e comprometer sua qualidade e segurança O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água mineral natural e de tampas plásticas utilizadas em uma indústria localizada na grande Porto Alegre/RS. Foram analisadas 152 amostras de água do poço e 15 amostras de água envasada em garrafões de 20 litros, utilizando-se as técnicas de membrana filtrante e “pour plate”. Os microrganismos pesquisados foram aqueles preconizados pela RDC 275/2005, da ANVISA, além da contagem total de microrganismos heterotróficos.O número de microrganismos heterotrófi cos também foianalisado em 22 tampas plásticas de garrafões de 20 litros.Os resultados demonstraram que em nenhuma amostra foi detectada a presença de coliformes totais, coliformes fecais/Escherichia coli, Enterococcus spp., Pseudomonasaeruginosa e Clostridium perfringens. Todas as amostras analisadas continham microrganismos viáveis, sendo que as contagens de microrganismos heterotróficos variaram de 1,0x10¹UFC/mL a 7,0x103UFC/mL. As tampas plásticasapresentaram contagens que variaram de 6,0x10¹UFC/mL a 1,2x10²UFC/mL e essa contaminação representouaproximadamente 0,003 a 0,006% das contagens totais obtidas nos garrafões analisados. Os resultados indicaramque a água mineral natural estava dentro dos padrões exigidospela legislação brasileira, além de demonstrar que aavaliação microbiológica foi importante como ferramenta para a melhoria dos processos empregados pela indústria em questão.
Um aumento expressivo no consumo de água mineral natural tem ocorrido em muitos países. 10 No Brasil, isso pode ser explicado devido aos freqüentes sabores e odores causados pela adição de fl úor e cloro nas águas de abastecimento público e também devido ao maior número de empresas de distribuição de água mineral natural. 13 Além desses fatores, somam-se outros como a desconfi ança por parte da população na qualidade das águas de distribuição pública e o preço mais acessível da água mineral natural,
nos últimos anos.
O Brasil está classifi cado em oitavo lugar no mercado mundial de águas, com uma produção de 6,1 bilhões de litros em 2006. 3 A expectativa do setor é de que, até o ano de 2010, a produção brasileira de água mineral atinja 11 bilhões de litros por ano. 11 O aumento desse consumo tem sido impulsionado pela percepção de que o consumo de água mineral está ligado a um estilo de vida saudável e por se acreditar que estes produtos são seguros. Em relação às embalagens, o Brasil se destaca no mercado mundial por concentrar cerca de 60% de suas vendas em garrafões de 20 litros. Uma vez que essas embalagens são retornáveis, a higienização dos garrafões tem sido um fator preocupante na indústria de águas envasadas.Embora águas minerais naturais adequadamente extraídas devam apresentar qualidade microbiológica elevada, diversos microrganismos fazem parte da flora natural desse alimento. Dessa forma, análises laboratoriais da água mineral natural podem e até devem demonstrar a presença de bactérias capazes de crescer e formar colônias em meios de cultura apropriados. 18, 23 A maioria da fl ora endógena da água mineral natural é classifi cada como Gram-negativa, ao contrário da flora contaminante que, geralmente, é Grampositiva. As bactérias heterotrófi cas da água mineral natural são consideradas psicrotrófi cas, ou seja, são bactérias mesófilas com capacidade de crescimento em temperaturas de refrigeração. Tal característica ocorre porque geralmente a temperatura das águas minerais naturais dentro dos poços é baixa, propiciando a adaptação bacteriana. Ainda que contagens bacterianas sejam naturalmente esperadas nas águas minerais naturais, contaminações mais elevadas podem ocorrer e comprometer sua qualidade e segurança. Quantidades expressivas de microrganismos têm sido relatados em diversos estudos, 1, 9, 24 motivando um maior controle por parte das autoridades sanitárias brasileiras, nos últimos anos. Como prova disso, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) publicou, em 2005, os padrões de identidade e qualidade da água mineral natural na RDC 274 e os padrões microbiológicos na RDC 275..Esse último regulamento prevê a ausência em 100mL (amostra indicativa) ou menos de 2,0 UFC/100mL (amostra representativa) de Escherichia coli ou coliformes fecais; coliformes totais, Enterococcus spp., Pseudomonas
aeruginosa e Clostridium perfringens. Já no ano de 2006, a mesma agência reguladora publicou a RDC 173, estabelecendo as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e os Procedimentos Operacionais Padronizados (POP) para estabelecimentos industrializadores de água mineral natural. .Além disso, esse setor é tradicionalmente regulado pelo Departamento Nacional de Produção Mineral (DNPM) que publicou, em 1997, a Portaria 222 que estabelece as exigências para exploração e fiscalização de águas minerais e potáveis de mesa. Baseado nessas legislações e em uma iniciativa conjunta entre a Vigilância Sanitária do Rio Grande do Sul e o DNPM, contando com o auxílio do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos ICTA/UFRGS, SENAI/RS e CIENTEC, houve a organização de cursos de capacitação e maior vigor nas fiscalizações das indústrias de água mineral natural do Rio Grande do Sul. Tais ações levaram a melhorias em grande parte dessas indústrias e objetivaram aprimorar o seu controle de qualidade e prevenir a contaminação microbiológica das águas minerais envasadas.
Tendo em vista os aspectos mencionados, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a qualidade microbiológica da água mineral natural e de tampas plásticas das bombonas de 20 litros de uma indústria localizada na grande Porto Alegre/RS.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostragem:
Foram coletadas amostras individuais de 100mL de água mineral natural, tanto do poço (n=152) quanto do produto final envasado (n=15) de uma indústria localizada na Cidade de Novo Hamburgo, Grande Porto Alegre/RS. As amostras do poço foram coletadas na casa de captação através de torneira própria para coleta de amostras.O poço de onde as amostras foram coletadas apresentava uma profundidade de 100 metros e o segmento rochoso do aqüífero era de arenito Botucatu. A casa de captação, assim como as torneiras para a coleta das amostras, apresentavam adequação conforme a RDC 173/2006 da ANVISA 5 e
Portaria 222/97 do DNPM. 8 As amostras foram coletadas em frascos com capacidade para 100 ou 250mL, esterilizados em autoclave a 121°C/15 minutos. As coletas foram realizadas no período de julho a novembro de 2007, em 5 visitas à indústria. Foram coletadas 30 amostras da água do poço em cada uma das quatro primeiras visitas, e 32 amostras na quinta visita, somando as 152 amostras acima citadas. Em cada visita também foram coletadas três amostras da água envasada em garrafões de 20 litros, perfazendo o total de 15 amostras de água dos garrafões. Três a Cinco amostras coletadas em cada dia de coleta foram analisadas para cada um dos microrganismos preconizados pela RDC 275/2005 da ANVISA 7 (coliformes fecais, coliformes totais, Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa e Clostridium perfringens). Nas quatro primeiras coletas foram analisadas oito amostras de água para microrganismos heterotróficos totais. Na quinta coleta esses microrganismos foram analisados em 9 amostras de água de poço. Após as coletas, as amostras foram acondicionadas em bolsa térmica e transportadas imediatamente ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos da UFRGS, onde foram analisadas.
Análises Microbiológicas de Amostras de Água Mineral
Dentre as 152 amostras de 100mL de água mineralnatural do poço, 41 foram analisadas para contagem de microrganismos heterotróficos, 25 para contagem de Clostridium perfringens, 25 para contagem de Pseudomonas aeruginosa, 25 para contagem de Enterococcus spp. e 18 para contagem de coliformes totais e coliformes fecais. As 15 amostras de 100mL de 15 garrafões de 20 litros foram analisadas para os mesmos microrganismos acima citados.Contagem de microrganismos heterotrófi cos
A técnica do “pour plate” foi utilizada para realizar as contagens de microrganismos heterotrófi cos. Para tanto, as amostras foram diluídas em água peptonada 0,1% estérile alíquotas de 1mL foram semeadas nos meios Plate Count Agar (PCA, MERCK, Darmastadt, Alemanha) e R2A (Himedia,Mumbai, India). As placas foram incubadas a 35°C, por 24/48 horas.Análise de patógenos A técnica de membrana fi ltrante (membrana com 47mm de diâmetro e porosidade de 0,45μm) foi utilizada para análise de Enterococcus spp., coliformes totais e fecais, Pseudomonas aeruginosa e Clostridium perfringens (3; 24). Para isso, foram fi ltrados 100mL de cada amostra, para cada microrganismo. Após a fi ltração, as membranas foram colocadas sobre Ágar m-Enterococcus (Himedia, Mumbai, India), para contagem de Enterococcus spp., e em Ágar m-Endo (Himedia, Mumbai, India), para contagem de coliformes totais e fecais, sendo incubadas em temperatura de 35ºC, por 24 e 48h, respectivamente. Para contagem de Pseudomonas aeruginosa, as membranas foram colocadas sobre Ágar Cetrimide (Himedia, Mumbai, India), incubadas a 41,5°C, por 96h, enquanto que para detecção de Clostridium perfringens, as membranas foram colocadas sobre meio SPS (Himedia, Mumbai, India), os quais foram incubadas a 35°C, por 24/48h, em jarra de anaerobiose, contenbia. A confi rmação de coliformes totais, fecais/Escherichia coli foi realizada através do produto Aquateste COLI (Laborclin, Pinhais, PR), em 5 amostras de 100mL, coletadas separadamente, uma a cada dia de coleta. Análise microbiológica das tampas dos garrafões Foram coletadas 22 tampas novas para garrafões de 20 litros de dentro das suas embalagens plásticas originais.Utilizando luvas estéreis, as tampas foram colocadas dentro de sacos plásticos estéreis para serem transportadas até o laboratório de análise. As tampas foram analisadas quanto à contagem de microrganismos heterotrófi cos totais, através da técnica do pour plate. Para tanto, em condições assépticas, foram adicionados 2mL de água peptonada 0,1% estéril, na parte interna de cada tampa sem uso. As tampas foram agitadas manualmente, por dois minutos e 1mL foi coletado e semeado em meio R2A. Em seguida, as placas foram incubadas em temperatura de 35ºC, por 24h e então as Unidades Formadoras de Colônia (UFC) foram quantificadas. Todas as análises foram realizadas em duplicata e os resultados foram expressos em UFC/mL.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados das análises microbianas estão demonstrados na Tabela 1. No primeiro dia de coleta (dia 1), as contagens de bactérias heterotrófi cas variaram de 2,4x103UFC/mL até 7,0x103UFC/mL, com média de 4,0x103UFC/mL.Contagens mais baixas foram observadas nos dias de coleta2, 3 e 4, as quais variaram de 1,0x102UFC/mL (dia 2) a 9,8x102UFC/mL (dia 3), com médias de 2,7x102UFC/mL, 6,2x102UFC/mL e 5,5X102UFC/mL, respectivamente. A diferença entre as contagens obtidas no primeiro
dia com as demais pode ser explicada devido ao fato de ter ocorrido uma higienização com 200ppm de cloro livre, por 30 minutos, nos tanques de armazenamento depois da coleta 1. As contagens no dia de coleta 5 foram ainda mais baixas, variando de 1,0x101UFC/mL a 1,4x102UFC/mL com média de 6,0x101UFC/mL, as quais podem ser justificadas por mais uma higienização desses tanques. Leclerc &Moreau 18 consideram a contagem total de microrganismos heterotrófi cos de grande importância em água mineral natural, uma vez que ajuda a monitorar prováveis alterações desde a fonte até o produto fi nal envasado. Além disso, os mesmos autores relataram que esse tipo de análise pode auxiliar na identifi cação de fontes de contaminação ou se o produto foi adulterado por agentes sanifi cantes, haja vista que a água mineral natural deve apresentar contaminação por bactérias indígenas.
Segundo Jayasekara et al. 14 amostras de água mineral natural diretamente no aqüífero podem ter uma população bacteriana de 10 a 100 UFC/mL, as quais são geralmente psicrotróficas, aeróbias, saprofíticas e Gram negativas. A presença de bactérias Gram positivas geralmente indica contaminação externa do poço. Embora a legislação brasileira não estabeleça parâmetros para as contagens de bactérias heterotrófi cas na água mineral natural, essas análises são bastante importantes para as indústrias desse alimento, uma vez que além de fornecerem informações valiosas, são de fácil realização, economicamente acessíveis e relativamente rápidas. Contudo, alguns cuidados devem ser tomados na realização dessas análises. No presente estudo amostras foram semeadas paralelamente em dois tipos de meio de cultura próprios para contagem de bactérias heterotróficas (PCA e R2A). Enquanto a média das contagens obtidas no meio PCA foi de 1,9x101UFC/mL, a média das contagens no meio R2A foi de praticamente o dobro, ou seja, 3,3x101UFC/mL (resultados não mostrados).
Estes resultados conferem com os estudos de Reasoner & Geldreich, 22 Leclerc & Moreau 18 que afi rmam que quando o meio R2A é utilizado para quantificação de microrganismos em amostras ambientais, um signifi cativo aumento nas contagens viáveis pode ser observado se comparado com o meio PCA. Resultados ainda melhores podem ser obtidos quando amostras de água mineral natural são semeadas em meio R2A, incubado a 20oC, ao invés de PCA a 37oC. 17. A diferença entre as contagens de uma mesma amostra semeada em dois meios também pode ser, em parte, explicada pelo estado Viável, mas Não Cultivável (VNC) que alguns microrganismos da água mineral podem apresentar. Esse estado, assim como outra condição fisiológica bacteriana conhecida como Fome-Sobrevivência, podem ocorrer em microrganismos presentes em águas mineraisnaturais, uma vez que esses ambientes são considerados oligotróficos e apresentam pouca matéria orgânica pare ser utilizada como fonte de nutrientes. Devido à falta de um parâmetro ofi cial para a contagem de microrganismos heterotrófi cos em águas minerais naturais (RDC 275/2005), 7 indústrias do setor freqüentemente adotam o padrão utilizado em água potável no Brasil (Portaria 518/2004) 4 como referência, o qual é de 500UFC/mL. Os resultados do presente estudo demonstraram contagens inicialmente maiores que esse parâmetro (dia de coleta 1), contudo, após as higienizações dos tanques de armazenamento, as contagens foram expressivamente reduzidas, demonstrando a eficiência e necessidade desse procedimento. Em todas as amostras analisadas não foram encontrados Enterococcus spp, Clostrudium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, corroborando a adequação da qualidade da água mineral natural analisada. Nascimento et al. 20 verifi caram que em 70 amostras analisadas de duas fontes, 35 amostras referentes a uma delas encontravam-se fora dos padrões vigentes, sendo a presença de Paeruginosa uma das causas de irregularidade. Já Giacometti et al. 13 encontraram Enterococcus spp. e clostridios sulfi to redutores em 18% e 3%, respectivamente ,de 225 amostras de água mineral natural envasada, no município de Jaboticabal/SP.Não foram encontrados coliformes totais, colifornes fecais /E. coli em nenhuma das amostras analisadas por ambas técnicas empregadas (membrana fi ltrante e Aquateste COLI). Cabrini & Gallo, 9 ao analisarem águas minerais naturais envasadas na cidade de Piracicaba- São Paulo/Brasil encontraram duas, de 21 amostras, positivas para coliformes totais. Embora nenhuma das amostras das águas envasadas tenha apresentado contaminação por coliformes totais, fecais, E. coli, P. aeruginosa, Enterococcus spp. e Clostridium sulfi to redutores, as contagens de bactérias heterotróficas encontradas nos garrafões de 20 litros foram expressivamente maiores que as contagens da água do poço nos dias 2, 3, 4 e 5 (Tabela 1), realizadas após higienização dos tanques de armazenamento. Essas contagens variaram de 1,0x10¹UFCmL até 4,1x103UFC/mL, com média de 1,3x103UFC/mL (Tabela 2). Tal aumento na contaminação microbiana pode ser justifi cado pela contaminação devido às diferentes etapas de processamento da água mineral ou pela multiplicação bacteriana dentro das bombonas. Leclerc & Da Costa 17 reportaram que após envasada, o número de microrganismos viáveis na água mineral natural pode aumentar rapidamente, atingindo 104-105UFC/mL. Esse aumento, conhecido como “efeito Garrafa” pode ser justifi cado, em parte, devido à matéria orgânica adsorvida nas paredes dosenvases. 15 As contagens microbianas podem aumentar nos primeiros dias de envase, diminuindo nas semanas subseqüentes até atingirem uma estabilização.
O aumento das contagens totais nos garrafões também pode ser devido à falhas nas higienizações dos mesmos.Cabrini & Gallo, 9 ao analisar amostras correspondentes a galões de 10L, 1,5L e 500mL, verifi caram contaminação de coliformes apenas nos galões de 10L, assim como a maior contagem total de heterótrofi cos (8,1x104UFC/mL).Esta contaminação pode estar associada às embalagens, uma vez que os galões de 10L eram retornáveis e passiveis de ter apresentado problemas durante a higienização. Para Cardoso et al. 10 a integridade física de embalagens utilizadas para o envase de água mineral natural deve sofrer inspeção individual, seguida de sanifi cação em lavadoras especificas, as quais devem localizar-se o mais próximo da sala de envase. Nas 22 tampas sem uso de garrafões de 20 litros analisadas, a contagem de microrganismos heterotróficos variou de 6,0x10¹UFC/mL a 1,2x10²UFC/mL, sendo que a contaminação representou aproximadamente 0,003 a 0,006% das contagens totais obtidas nos garrafões analisados. Jones et al. 16 verifi caram que a contaminação de tampas de envase de 1,5 litros foi de 11 a 632 UFC/cm2 e representou de 0,03 a 1,79% da contagem total de microrganismos heterotrófi cos das águas envasadas
.
CONCLUSÕES
Após a análise dos resultados, conclui-se que a água mineral natural analisada demonstrou estar dentro dos padrões exigidos pela legislação brasileira e que a avaliação microbiológica dessas amostras pôde auxiliar na melhoria dos processos empregados pela indústria em questão.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Indústria Liquid Gold por possibilitar esse trabalho.
RITTER, A. C.; TONDO, E. C. Evaluation the microbiological quality of mineral water samples and
plastic covers used in an industry of bottled mineral water located in Porto Alegre/RS. Alim. Nutr., Araraquara, v. 20, n. 2, p. 201-206, abr./jun. 2009.
ABSTRACT: Although bacterial counts are naturally expected in bottled mineral waters, higher bacterial levels can occur and compromise their quality and safety. The objective of this study was to evaluate the microbiological quality of mineral water samples and plastic covers used in an industry of bottled mineral water located in Porto Alegre/RS, Southern Brazil. Samples of mineral water were colleted from the well (n=152) and from 20 liters water bottles (n=15) and were analyzed by membrane fi lter and pour plate methods, for the microorganisms recommended by RDC 275/2005 of ANVISA. All samples, including plastic covers (n=22), were also analysed for heterotrophic bacterial counts. The results demonstrated that fecal and total coliforms, Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa and Clostridium perfringens were not found in any sample. All samples contained viable microorganisms, being that the counts of heterotrophic bacteria ranged from 1.0 x 10¹ cfu/ml to 7.0 x103 cfu/ml. Plastic covers present counts between 6.0 x 10¹ cfu/ml to 1.2 x 10² cfu/ml, and such contamination represented approximately 0.003 to 0.006 % of the counts obtained in bottled water samples. The results indicated that the bottled mineral waters examined demonstrated to be within the standards required by Brazilian regulations, and that microbiological analysis were important as a tool for improving the quality processes employed by the industry investigated.
KEYWORDS: Natural mineral water; microbiological quality; microorganisms plate counts.
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